От зарина и до «Новичка» — всем поколениям и разновидностям ядовитых фосфорорганических веществ противостоят антидоты — от обычного атропина до белков,синтезированных генно-модифицированными клетками.

Самую широкую известность получила история Сергея Скрипаля, хотя каждый год со сходными отравлениями сталкиваются около 3 млн человек, и для более чем 200 тыс. это заканчивается летально. Фосфорорганические вещества (ФОВ) бывают не только боевыми и встречаются далеко за пределами секретных лабораторий. Нарушая передачу сигналов между нейронами, ФОВ смертельно ядовиты для любого существа, обладающего нервной системой, и широко используются для борьбы с вредителями-насекомыми. Они входят в состав некоторых бытовых средств против муравьев и тараканов и применяются в качестве инсектицидов в сельском хозяйстве. С плохо мытыми овощами, фруктами, зеленью и приготовленными из них продуктами они могут попадать и в наш организм — через желудочно-кишечный тракт, верхние дыхательные пути и даже сквозь кожу.

«Работая по этой теме, я постоянно отслеживал соответствующие публикации в Twitter, — рассказал нам исследователь из Института биохимии (ИБХ) РАН Денис Илюшин. — И не реже нескольких раз в неделю попадались такие сообщения: «Представляете, мне диагностировали отравление нервно-паралитическим ядом»». Впрочем, немало таких случаев оказываются намеренными: крестьяне беднейших стран нередко прибегают к инсектицидам для самоубийства, и ФОВ выступают одним из самых распространенных средств для того, чтобы поставить тяжелую точку в конце тяжелой жизни. Карбофос и дихлофос, хлорофос и диазинон — недаром все эти названия звучат почти так же зловеще, как зарин, зоман или даже «Новичок» и табун.

Табун

Опасность фосфорорганики была осознана далеко не сразу — и, разумеется, добром это не кончилось. Знаменательный случай массового отравления произошел в США в годы сухого закона, когда бутлегеры наладили производство эрзац-спиртного для обхода установленных ограничений. В ямайскую имбирную настойку, якобы предназначенную строго для медицинского использования, добавляли вещества, делавшие ее непригодной для употребления в сколько-нибудь серьезных количествах. Однако 70−80% этанола перевешивали любые добавки, и вскоре среди любителей выпить стали отмечаться случаи внезапного паралича конечностей. Общее число жертв той эпидемии оценивается в десятки тысяч, и далеко не всем из них удалось полностью восстановиться. Расследование указало на виновника беды — фосфорорганический загуститель трикрезилфосфат.

Органофосфаты обладают накапливающимся токсическим действием, и длительный контакт с ними чреват более серьезными последствиями. В последние годы их применение в сельском хозяйстве понемногу сокращается.

Именно с начала 1930-х работающие с ФОВ химики стали изучать и обсуждать их опасное токсическое действие. Начался поиск самых эффективных молекул, подходящих для борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений. Так в декабре 1936 года исследователи немецкого концерна IG Farben получили летучую, с фруктовым запахом жидкость, которая в опытах с тлей показала себя особенно перспективной. А уже в январе 1937-го несколько капель вещества, случайно пролитые в лаборатории, вызвали отравление у химика Герхарда Шрадера и его ассистента. Следуя инструкциям, принятым к тому времени правительством Рейха, ученый отправил образец жидкости военным. С этого началась история отравляющих ФОВ нервно-паралитического действия.

Действие

Нейроны обмениваются сигналами в химической форме: одна клетка выделяет в синапс молекулы-нейромедиаторы, а другая реагирует на них. Одним из главных нейромедиаторов выступает ацетилхолин. Он синтезируется пресинаптическим нейроном и накапливается во внутриклеточных пузырьках, которые по команде впрыскивают ацетилхолин в просвет синапса. Рецепторы на мембране следующей клетки связывают нейромедиатор и передают сигнал дальше, а расположенные тут же ферменты быстро разлагают остатки ацетилхолина, расчищая синапс для следующего срабатывания. Именно на этом, последнем этапе действуют ФОВ: мимикрируя под ацетилхолин, они блокируют работу ацетилхолинэстераз (АХЭ), в результате нейромедиатор накапливается в синапсах и нейроны начинают срабатывать хаотично и безостановочно.

Действие ФОВ и антидотов на ацетилхолиновые рецепторы
Зарин воздействует на мускариновые и никотиновые рецепторы ацетилхолина. Атропин снижает воздействие ФОВ на м-рецепторы, а пралидоксим позволяет восстанавливать функциональность АХЭ в обоих видах синапсов.

Для удобства формулу фосфорной кислоты можно записать как O = P-(OH)3. В ее эфирах одна или несколько ОН-групп могут замещаться другими, одинаковыми или разными. Строго говоря, такими эфирами являются многие важные биологические молекулы, включая ДНК, РНК и АТФ. Однако некоторые органические эфиры фосфорной кислоты также связывают АХЭ, не давая ей дезактивировать нейромедиатор. Поначалу эту связь еще можно разорвать, однако со временем токсин проходит спонтанное превращение, вызывая стойкие изменения в структуре белка — «старение» ацетилхолинэстеразы, — и полностью выводит его из строя. Эти процессы могут развиваться в течение секунд (как для фтор-фосфорилхолина), минут (у зомана) или суток (VX-газ). Однако восстановление потребует долгих месяцев, пока организм не заместит «испорченные» молекулы новыми и не восстановит работу ацетилхолиновых рецепторов.

Симптомы

Нейроны, чувствительные к ацетилхолину, работают повсюду, и подавление АХЭ затрагивает их все, а при достаточных количествах ФОВ воздействуют на рецепторы и напрямую. В разных тканях холинергические рецепторы различаются по структуре, функциям и взаимодействию с фармакологическими препаратами. Мускарин (алкалоид, содержащийся в мухоморах и других ядовитых грибах) активнее влияет на м-холинорецепторы, расположенные в сердце, мозге и парасимпатических нервных волокнах, управляющих работой внутренних желез и гладкой мускулатуры. Чувствительные к никотину н-холинорецепторы играют главную роль в стимуляции поперечно-полосатых мышц, включая те, что обеспечивают дыхание. Именно на них быстрее всего проявляется воздействие ФОВ, приводя к параличу и — в худшем случае — гибели от асфиксии. Активация м-рецепторов вызывает не столь стремительные, но не менее тяжелые эффекты.

Спазмы гладкой мускулатуры проявляются сильным сужением зрачка, нарушениями сердечного ритма и кровяного давления, тошнотой и рвотой, диареей, слюнотечением, потливостью, головокружением и сбивчивостью сознания — вплоть до комы. Так выглядит отравление любыми ФОВ, начиная от табуна и на протяжении нескольких поколений, над которыми химики официально работали вплоть до конца 1980-х. Сюда входят и газы G-класса, созданные еще в нацистской Германии: табун, зарин, зоман и близкие к ним соединения; полученные в 1950-х в Великобритании V-газы, включая VX, самое токсичное из существующих боевых отравляющих веществ; полулегендарные соединения семейства «Новичок». Они различаются степенью опасности, простотой производства и хранения, но механизм воздействия остается тем же. И что бы ни послужило источником яда, шпионские ли страсти или фермерские ошибки, нейтрализовать его можно одинаковыми мерами.

Противодействие

Из антидотов, позволяющих защититься от токсичного действия ФОВ, самым известным стал атропин. Его использование вообще имеет длинную историю. Атропин содержится в растениях семейства пасленовых, включая мандрагору и белладонну. Еще в Древнем Египте и в Древней Греции они применялись для достижения либо галлюцинаторного и «психоделического», либо эротического воздействия: расширенные зрачки тогда считались очень сексуальными. Как и ФОВ, атропин схож с молекулой ацетилхолина и конкурирует с ней и с токсинами за связывание АХЭ. Однако его соединение с ферментом обратимо, и после нескольких чрезвычайно неприятных минут человек приходит в себя. Эти эффекты настолько ценны, что атропин включен в Примерный перечень основных лекарственных средств, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения.

Отталкиваясь от атропина и его аналогов, химики разработали мощные коктейли антидотов, включающие вещества, быстро и целенаправленно воздействующие на н- и м-холинорецепторы. В старой аптечке для «оказания само- и взаимопомощи в случае ранений или поражений оружием массового поражения» АИ-2 это был препарат афин, в принятой не так давно АИ-4 — пеликсим, шприц-тюбик с красным колпачком. При отравлении препарат позволяет пережить первый удар ФОВ и применить лекарства следующего шага, такие как изонитрозин, способный освободить холинэстеразу от связанного токсина. Пока не прошло ее «старение», реактивация молекул фермента вполне возможна. Тем не менее существующие антидоты можно назвать меньшим из двух зол. Конкурируя с токсином, они сильно и опасно воздействуют на холинергические нейроны и всю нервную систему. Поэтому в последние годы внимание специалистов привлекла концепция антидотов совершенно нового типа — естественных «биологических чистильщиков».

Иван Смирнов, доктор химических наук, заведующий Лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН: «Российское сельское хозяйство остается одним из главных потребителей фосфорорганики. Однако существующие методы терапии и профилактики обычными антидотами — это, по сути, использование конкурирующих ядов, и переносится оно тяжело. Боевые отравляющие вещества действуют быстро, используются в избыточных концентрациях и в «условиях боевой тактической внезапности», так что крайние меры для лечения совершенно понятны. Но это не лучший подход при отравлении обычным инсектицидом».

Чистильщики

«Концепция «живого чистильщика» (bioscavenger) была озвучена еще в конце 1980-х, — объясняет заведующий лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Иван Смирнов. — Это антидот биологического происхождения, естественный и безвредный для организма, который способен действовать как «перехватчик» и снижать концентрацию токсина». Такой препарат может стать более мягким и эффективным средством лечения и профилактики отравления ФОВ, нежели грубая терапия антидотами. Подходящий кандидат на эту роль известен: бутирилхолинэстераза (БХЭ) — «младшая» из двух холинэстераз, которые имеются в человеческом организме. Свободно плавающая в крови БХЭ теряется на фоне своей знаменитой родственницы ацетилхолинэстеразы, хотя по числу молекул и превосходит ее на порядки.

Даже функции БХЭ остаются неизвестны; по одной из версий, «чистильщик» — естественная роль этого фермента. БХЭ взаимодействует с любыми подходящими молекулами эфиров, связывает и нейтрализует их, защищая холинергические нейроны от веществ, способных заместить ацетилхолин и нарушить их работу. Гипотезу эту подтверждают и некоторые эксперименты: показано, что неспособные синтезировать БХЭ ГМ-мыши особенно чувствительны к токсическому действию ФОВ. Выделить БХЭ можно непосредственно из донорской крови, в том числе просроченной и не подходящей для переливания. Однако для получения одной эффективной дозы понадобится переработать сотни литров плазмы, и стоимость ее окажется слишком велика. Эта проблема стимулирует поиски альтернативных путей производства.

Производство

Стандартные подходы с перенесением человеческого гена БХЭ в клетки дрожжей и кишечной палочки не сработали. Микробы оказались неспособны синтезировать эти сложные, необычные для них молекулы. Поэтому исследователям пришлось обратиться к клеткам яичников китайского хомячка (Chinese hamster ovary, CHO), которые широко используются для промышленного синтеза антител и других белков. За несколько лет работы Денису Илюшину и его коллегам из лаборатории биокатализа ИБХ РАН удалось получить новую линию СНО-клеток и довести продуктивность производства БХЭ до 70 мг/мл. Это более чем вдесятеро больше, чем содержится белка в плазме крови, и достаточно для рентабельного производства.

«Активность белка мы проверяли на двух ФОВ, включая и боевое отравляющее вещество, агент VX, — рассказывает Денис. — Разумеется, что с ним мы не экспериментировали и сдавали препарат на испытания в закрытый ГосНИИОХТ, где занимаются проблемами химического оружия. Система, можно сказать, создана: белок показал нужную активность, линия клеток сохраняется в криогенных условиях и готова к использованию в любой момент». Однако и эту систему можно значительно улучшить. «Андрей Головин и его команда на факультете биоинформатики и биоинженерии МГУ занимаются расчетной стороной этой работы, — говорит Иван Смирнов. — Они моделируют взаимодействия БХЭ с различными фосфорорганическими молекулами и подбирают такие мутации, которые могут сделать это взаимодействие каталитическим. А мы затем проверяем их у себя в лаборатории».

В самом деле, пока что белок способен лишь связывать и выводить токсин из оборота. Но если он сможет разлагать молекулы ФОВ, то его нейтрализующее действие будет намного эффективнее. Впрочем, и этим перспективы БХЭ далеко не ограничиваются. Фермент способен связывать многие другие соединения, влияющие на работу ацетилхолиновых рецепторов, включая наркотики. Так что «антидот от кокаина» может стать естественным продолжением короткой, но бурной истории применения фосфорорганических ядов и борьбы с ними.

источник